北京時間4月4日，國際學(xué)術(shù)期刊Cell在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所）周斌研究組的最新成果“Tracing the origin of alveolar stem cells in lung repair and regeneration”。該研究建立了追蹤肺上皮細胞的Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤新技術(shù)，結(jié)合多種小鼠肺臟損傷模型，系統(tǒng)研究了肺泡上皮干細胞的再生起源并揭示其細胞命運調(diào)控的分子機制。該工作不僅為肺臟疾病的臨床治療研究提供了新的科學(xué)依據(jù)和突破口，也為器官發(fā)育和再生醫(yī)學(xué)研究提供了新技術(shù)和新方法。

肺作為一個復(fù)雜的多功能器官，對人類生存至關(guān)重要。肺上皮干細胞在肺臟再生修復(fù)中發(fā)揮重要作用，是肺臟再生和肺疾病領(lǐng)域的研究熱點。以小鼠肺臟為例，肺葉內(nèi)部主要包括支氣管和肺泡兩個區(qū)域。不同區(qū)域的肺上皮細胞種類和數(shù)目不同，并且含有各自的干細胞負責(zé)本區(qū)域上皮的穩(wěn)態(tài)維持及損傷修復(fù)。支氣管上皮主要由棒狀細胞（Club cell，分子標記為Scgb1a1）、纖毛細胞（Ciliated cell）和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞（Neuroendocrine cell, NE cell）等細胞構(gòu)成，其中Club細胞和NE細胞屬于干細胞，能維持支氣管上皮更新；肺泡上皮主要由I型肺泡上皮細胞（Alveolar type I cell, AT1 cell）和II型肺泡上皮細胞（Alveolar type II cell, AT2 cell，分子標記為Sftpc）構(gòu)成，其中AT2細胞作為肺泡干細胞能自我更新并分化為AT1細胞；在支氣管和肺泡區(qū)域交界的位置，還存在一群支氣管肺泡干細胞（Bronchioalveolar stem cells, BASCs），具有同時表達club細胞分子標記Scgb1a1和AT2細胞分子標記Sftpc的特點，周斌團隊前期研究揭示了BASCs在肺損傷后具有向支氣管和肺泡上皮雙向分化的潛能。

AT2細胞作為肺泡上皮干細胞在肺泡損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。因此鑒定和闡明AT2肺泡干細胞的再生起源及分子調(diào)控機制對肺臟疾病的治療具有重要意義。近年來陸續(xù)有重要研究成果報道，發(fā)現(xiàn)在肺臟受損后，AT2細胞除了來源于自我更新外，還會起源于AT1細胞和club細胞，這些關(guān)于肺臟干細胞突破性的研究發(fā)現(xiàn)，極大推進了肺臟再生領(lǐng)域的發(fā)展。然而由于肺干細胞研究領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的傳統(tǒng)譜系示蹤技術(shù)存在非特異性標記的缺陷，導(dǎo)致這些重大發(fā)現(xiàn)一直存在科學(xué)爭議，因此亟需構(gòu)建譜系示蹤新技術(shù)對這些科學(xué)爭議一一進行闡明。周斌團隊長期致力于小鼠體內(nèi)譜系示蹤新技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，曾利用雙重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)解決了多個領(lǐng)域內(nèi)重大科學(xué)問題，有力地推動了相關(guān)研究領(lǐng)域的發(fā)展和進步。

為了闡明AT2細胞的再生來源，研究人員首先對傳統(tǒng)的單同源重組酶驅(qū)動的譜系示蹤工具進行了系統(tǒng)性鑒定。Hopx-CreER是肺干細胞領(lǐng)域內(nèi)普遍使用的AT1細胞標記示蹤工具，對成體Hopx-CreER；R26-tdT工具小鼠進行肺切除手術(shù)（Pneumonectomy，PNX）或博來霉素（Bleomycin）誘導(dǎo)肺損傷后，發(fā)現(xiàn)標記的Hopx⁺細胞確實可以轉(zhuǎn)分化為AT2細胞。然而對穩(wěn)態(tài)下Hopx-CreER；R26-tdT工具小鼠的肺臟切片進行免疫熒光染色及統(tǒng)計分析后，發(fā)現(xiàn)此遺傳工具除了高效率標記AT1細胞外，還“異位”或者“非特異”標記~66% club細胞、~12% BASCs、~92% ciliated細胞，還有極少量AT2細胞（~0.24%）。由于BASCs、club細胞和AT2細胞本身已被報道可以作為干細胞在肺損后貢獻AT2細胞，因此會對Hopx-CreER；R26-tdT的譜系示蹤結(jié)果產(chǎn)生很大干擾。為了探究Hopx-CreER的非特異性標記是否由于Hopx一條等位基因敲除引起的，研究人員構(gòu)建了Hopx-2A-DreER。通過對Hopx-2A-DreER；R26-RSR-tdT工具小鼠肺臟進行檢測，同樣的發(fā)現(xiàn)tdTomato除了標記AT1細胞外，還“非特異”標記ciliated細胞、club細胞和少部分BASCs。研究人員進一步對另一種領(lǐng)域內(nèi)使用的AT1遺傳工具Ager-CreER進行鑒定，發(fā)現(xiàn)該工具除了高效率標記AT1細胞外還會“異位”標記一部分AT2細胞和少量BASCs。通過以上實驗，研究人員揭示基于Hopx基因或Ager基因的傳統(tǒng)單同源重組酶驅(qū)動的譜系示蹤技術(shù)具有非特異性標記問題，因此無法利用其對AT1細胞進行嚴格的譜系示蹤研究。

得到以上結(jié)果后，研究人員意識到領(lǐng)域內(nèi)迫切需要構(gòu)建譜系示蹤新技術(shù)來實現(xiàn)對AT1細胞的特異性標記，于是提出利用雙同源重組酶驅(qū)動的譜系示蹤新技術(shù)來解決此難題。通過對比，研究人員發(fā)現(xiàn)Hopx-2A-DreER與Ager-CreER非特異性標記的細胞類型具有“互斥”特點，即Hopx-2A-DreER除了標記AT1細胞外會“異位”標記ciliated細胞、club細胞和少量BASCs，而Ager-CreER除了標記AT1細胞外會“異位”標記AT2細胞和少量BASCs。基于這個“互斥”特點，研究人員首先通過交叉標記策略（Intersectional strategy）構(gòu)建了雙同源重組遺傳工具：Hopx-2A-DreER；Ager-CreER；R26-RSR-LSL-tdT，只有同時發(fā)生Dre-rox和Cre-loxP重組的細胞中，報告基因tdTomato才會表達，進而實現(xiàn)對Hopx⁺Ager⁺ AT1細胞特異性標記。結(jié)合多種肺損傷模型（肺切、博來霉素和高氧損傷），研究人員發(fā)現(xiàn)在肺損后AT1細胞不會轉(zhuǎn)分化為AT2細胞，AT1細胞屬于終末分化細胞。研究人員進一步通過嵌套策略（Nested strategy）構(gòu)建了另一種雙同源重組遺傳工具：Hopx-2A-DreER；Sox2-CreER；Sftpc-CreER;R26-NR2。在此策略中，Hopx⁺AT1細胞會被特異性標記為ZsGreen，而“非特異”標記的club細胞、ciliated細胞、BASCs及AT2細胞均會被統(tǒng)一標記為tdTomato。然而結(jié)合多種肺損傷模型，研究人員仍然未檢測到標記的AT1細胞轉(zhuǎn)分化為AT2細胞。通過以上兩種雙同源重組譜系示蹤新技術(shù)，研究人員揭示在肺損后AT1細胞不具備可塑性，不會轉(zhuǎn)分化為AT2細胞。

研究人員進一步指出領(lǐng)域內(nèi)club細胞遺傳工具Scgb1a1-CreER同樣具有非特異性標記問題，Scgb1a1-CreER；R26-tdT除了標記club細胞外還會“異位”標記BASCs和少量AT2細胞，這會對club細胞的譜系示蹤結(jié)果產(chǎn)生干擾。因此研究人員基于Cre-loxP和Dre-rox構(gòu)建了另一種雙同源重組譜系示蹤新策略，即Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-TLR遺傳工具，解決以上非特異性標記問題。在此系統(tǒng)中club細胞內(nèi)會發(fā)生Cre-loxP重組被標記為tdTomato；AT2細胞內(nèi)會發(fā)生Dre-rox重組被標記為ZsGreen；BASCs內(nèi)同時發(fā)生Cre-loxP和Dre-rox重組會被標記為tdTomato和ZsGreen，從而展現(xiàn)出黃色熒光標記。因此，該新技術(shù)可以實現(xiàn)對club細胞、BASCs和AT2細胞這三種細胞群同時特異性遺傳標記，分別稱之為Club-tracer、AT2-tracer和BASC-tracer。結(jié)合博來霉素損傷模型，研究人員發(fā)現(xiàn)肺損后club細胞和BASCs會大量分化為肺泡上皮（包括AT2和AT1細胞）進而促進肺泡再生，對肺泡損傷區(qū)域進行統(tǒng)計，顯示~27%和~11%新生AT2細胞分別起源于club細胞和BASCs。為進一步挖掘club細胞對肺泡上皮修復(fù)的潛力，研究人員計劃通過誘導(dǎo)BASCs和AT2細胞過表達p21蛋白封閉細胞增殖能力，使之不能參與再生修復(fù)，以此激發(fā)club細胞的可塑性潛力。為了實現(xiàn)這一目的，研究人員設(shè)計了一種新的雙同源重組系統(tǒng)，即Sftpc-DreER；R26-rox-p21-GFP；Scgb1a1-CreER；R26-LZL-tdT遺傳工具，club細胞內(nèi)發(fā)生Cre-loxP重組被標記為tdTomato；AT2細胞內(nèi)會發(fā)生Dre-rox重組被標記為GFP并表達p21蛋白；BASCs內(nèi)同時發(fā)生Cre-loxP和Dre-rox重組會被標記為tdTomato和GFP并表達p21蛋白。對此系統(tǒng)成功驗證后，研究人員隨即結(jié)合博來霉素損傷模型來探究club細胞的可塑性。收取損傷4周后的肺臟進行分析，發(fā)現(xiàn)AT2細胞和BASCs原本的修復(fù)能力成功被抑制，并發(fā)現(xiàn)club細胞大量轉(zhuǎn)分化為新生AT2細胞和AT1細胞，統(tǒng)計顯示損傷區(qū)域~47%AT2細胞起源于club細胞。研究人員進一步分析了長時程（損傷后8個月）修復(fù)的肺臟，驚奇的發(fā)現(xiàn)與4周相比，club細胞貢獻的E-cad⁺肺泡上皮（包括AT2細胞和AT1細胞）比例顯著性上升，統(tǒng)計顯示~82% AT2細胞起源于club細胞。在損傷嚴重的肺葉中，club起源的肺泡上皮細胞可以覆蓋絕大部分肺泡區(qū)域。以上結(jié)果說明肺損后當AT2細胞和BASCs修復(fù)能力被抑制時，club細胞會被委以重任，成為肺泡干細胞再生的主要來源。

那么是何種信號通路調(diào)控club細胞及BASCs向AT2細胞發(fā)生細胞命運轉(zhuǎn)變？這兩種不同干細胞產(chǎn)生AT2細胞的分子調(diào)控機制是否一樣？為了探明這一點，研究人員首先從損傷4周的Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-TLR工具小鼠中分選了Club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer標記細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析（scRNA-seq）。UMAP分析顯示Club-tracer標記的細胞可以被劃分為7個細胞亞群（cell cluster），這些細胞亞群具有不同的基因表達特點，可依次劃為AT2細胞群、Club細胞群、Basal-like細胞群、Cldn18^highPreAT1細胞群、Fstl1⁺transient細胞群、transient細胞群和H2-K1⁺club細胞群。擬時序分析揭示這些細胞亞群之間具有緊密的譜系聯(lián)系，club細胞和H2-K1⁺club細胞作為起點可轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>Basal-like和Fstl1⁺ transient細胞，也可以通過transient細胞分化為AT2細胞和Cldn18^highPreAT1細胞。另一方面，UMAP分析顯示根據(jù)基因表達BASC-tracer標記的細胞也可被劃分為7個細胞亞群，包括Cldn4^highPreAT1細胞群、Cxcl15^highAT2細胞群、BASC-like 細胞群、Chil1^highAT2細胞群、Ereg^highAT2細胞群、transient細胞群和AT1細胞群。這些細胞亞群在基因表達譜系上具有連貫性，擬時序分析顯示細胞分化譜系起始于BASC-like細胞，然后經(jīng)過transient細胞可依次分化為Cxcl15^highAT2、Ereg^highAT2、Cldn4^highPreAT1及AT1細胞，或經(jīng)Cxcl15^highAT2可分化為Chil1^highAT2細胞。通過對Club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer中的AT2細胞進行對比分析，發(fā)現(xiàn)BASC-tracer中的AT2細胞在基因表達上更接近于AT2-tracer中的AT2細胞。

通過進一步分析，研究人員發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在club細胞向AT2細胞轉(zhuǎn)分化及BASCs向AT2轉(zhuǎn)分化過程中具有下調(diào)趨勢，暗示Notch信號通路可能在細胞命運轉(zhuǎn)變中發(fā)揮調(diào)控作用。為進一步體內(nèi)驗證，研究人員結(jié)合雙同源重組譜系示蹤技術(shù)與條件性基因敲除技術(shù)構(gòu)建了Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-TLR；Rbpj^flox/flox工具小鼠（實驗組）和Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-TLR；Rbpj^flox/+工具小鼠（對照組），可實現(xiàn)在體內(nèi)示蹤Club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer的同時實現(xiàn)在club細胞和BASCs中特異性敲除Notch信號通路。結(jié)合博來霉素損傷模型，研究人員發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲除組中club細胞貢獻的AT2細胞比例顯著性降低，而BASCs貢獻的AT2細胞比例顯著性上升。此實驗證實Notch通路在club及BASCs向AT2轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)揮重要作用，并且屬于兩種截然相反的調(diào)控作用。為進一步研究Notch通路激活是否會影響BASCs向AT2細胞轉(zhuǎn)分化，研究人員利用雙同源重組譜系示蹤技術(shù)構(gòu)建了Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-RL-NICD-GFP遺傳工具，可實現(xiàn)對BASCs特異性標記并過表達NICD。結(jié)合博來霉素損傷模型，研究人員發(fā)現(xiàn)與對照組（Scgb1a1-CreER；Sftpc-DreER；R26-RL-GFP）相比，過表達Notch會顯著抑制BASCs向AT2細胞轉(zhuǎn)分化。以上實驗證明club細胞可作為AT2細胞的再生起源，并且首次在功能層面上揭示club細胞與BASCs屬于兩種不同細胞類型，不僅具有不同基因表達特點，而且在向AT2細胞分化過程中受Notch通路相反的調(diào)控。

綜上，該研究通過構(gòu)建精準的雙同源重組譜系示蹤技術(shù)系統(tǒng)嚴格地解析了肺損傷后肺泡上皮干細胞的再生起源，并揭示其分子調(diào)控機制，為肺臟干細胞和修復(fù)再生領(lǐng)域提供新技術(shù)和新方法，也為肺臟疾病的臨床治療研究提供新的治療靶點和重要研究基礎(chǔ)。

國科大杭州高等研究院/中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組副研究員劉擴、上?？萍即髮W(xué)博士生孟鑫鳳和中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士生劉子鑫為該論文共同第一作者。周斌研究員為該論文通訊作者。該研究得到分子細胞卓越中心動物實驗技術(shù)平臺和細胞分析技術(shù)平臺及中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所細胞分析技術(shù)平臺的大力支持。該工作得到中國科學(xué)院、國家自然科學(xué)基金委、科技部、上海市科委、國科大杭州高等研究院、新基石科學(xué)基金會等支持。

文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.010

圖注：肺臟損傷后AT2細胞的再生起源

利用雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤技術(shù)特異性標記各種不同肺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)新生AT2細胞除了來源于自我更新外還會起源于club細胞與BASCs，而非AT1細胞。Notch信號通路在club細胞和BASCs向AT2細胞發(fā)生命運轉(zhuǎn)變中發(fā)揮截然相反的作用，即敲除Notch抑制club細胞向AT2細胞命運轉(zhuǎn)變，但促進BASCs向AT2細胞命運轉(zhuǎn)變。

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