12月21日，國際學(xué)術(shù)期刊Circulation發(fā)表了中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所）周斌組、上海交通大學(xué)新華醫(yī)院孫錕教授以及香港中文大學(xué)呂愛蘭教授合作的研究成果“Seamless Genetic Recording of Transiently Activated Mesenchymal Gene Expression in Endothelial Cells During Cardiac Fibrosis”。該研究利用遺傳譜系示蹤技術(shù)無縫隙記錄心臟內(nèi)皮細胞中間充質(zhì)基因的激活，揭示了胚胎期心內(nèi)膜內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變的過程（Endothelial to Mesenchymal Transition, EndoMT），發(fā)現(xiàn)在成體心臟損傷后纖維化過程中，大量的肌成纖維細胞不是由內(nèi)皮細胞通過EndoMT形成，而是來源于成纖維細胞的激活和轉(zhuǎn)變形成的，其過程有間充質(zhì)基因的瞬時表達。

　　近20年來，關(guān)于成體心臟纖維化過程中肌成纖維細胞的來源一直存在爭論，前期代表性研究發(fā)現(xiàn)成體心臟纖維化中內(nèi)皮細胞會通過EndoMT轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細胞（Zeisberg et al., Nature Medicine 2007），形成大量的肌成纖維細胞促進心臟纖維化，成為治療心臟纖維化的一個重要靶點。該結(jié)論主要是基于Cre-loxP單同源重組酶的譜系示蹤技術(shù)，存在時空分辨率較低，并可能有示蹤假陽性的技術(shù)問題。此外，目前也沒有技術(shù)能研究在成體心臟纖維化中內(nèi)皮細胞是否會發(fā)生可逆的EndoMT，短暫或瞬時地表達間充質(zhì)細胞的基因，由于缺乏研究手段并不清楚。

　　基于雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)（He et al., Nature Medicine 2017），研究人員建立了無縫隙捕捉間充質(zhì)基因激活的技術(shù)—EndoMTracer。αSMA是肌成纖維細胞的特征蛋白，也是指征間充質(zhì)細胞最常用的分子標記之一（Tallquist et al., Nat Rev Cardiol 2017），因此研究人員首先檢測內(nèi)皮細胞中是否會激活表達αSMA。當對小鼠用他莫昔芬誘導(dǎo)后，通過Cre-loxP重組，內(nèi)皮細胞會被特異地標記上ZsGreen的熒光蛋白，同時內(nèi)皮細胞中αSMA-LSL-Dre轉(zhuǎn)變成αSMA-Dre。在隨后的時間段內(nèi)，只要內(nèi)皮細胞短暫或瞬時的激活αSMA，那么就會表達出Dre重組酶，并發(fā)生Dre-rox重組，將該內(nèi)皮細胞永久的標記上tdTomato的熒光蛋白。EndoMTracer系統(tǒng)一旦通過他莫昔芬誘導(dǎo)，后續(xù)就可以持續(xù)地記錄內(nèi)皮細胞中αSMA的激活，tdTomato陽性代表著該內(nèi)皮細胞在檢測時間段內(nèi)激活過αSMA。

　　研究人員首先利用EndoMTracer技術(shù)捕捉胚胎期心內(nèi)膜向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變的過程。在母鼠懷孕8.5天后用他莫昔芬誘導(dǎo)EndoMTracer系統(tǒng)開啟，并收集17.5天的胚胎心臟樣本進行分析。研究人員在瓣膜處檢測到tdTomato陽性的間充質(zhì)細胞，但不表達αSMA，說明這些被標記的內(nèi)皮細胞曾經(jīng)表達過αSMA，發(fā)生EndoMT，并被EndoMTracer技術(shù)永久地記錄下來。

　　接下來，研究人員利用EndoMTracer技術(shù)捕捉成體心臟纖維化中EndoMT過程。對成體小鼠用他莫昔芬誘導(dǎo)后，研究人員采用了不同的損傷模型來誘導(dǎo)心臟纖維化過程：主動脈縮窄術(shù)和心肌梗死。在這兩種心臟損傷模型的不同時間點，均未檢測到tdTomato陽性的內(nèi)皮細胞，說明成體心臟內(nèi)皮細胞在纖維化過程中，不會瞬時激活間充質(zhì)細胞的特征基因αSMA，繼續(xù)保持著內(nèi)皮的特征。

　　機體損傷后，成纖維細胞被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，表達αSMA，促進損傷區(qū)域的纖維化。研究人員利用相同的策略捕捉成纖維細胞中αSMA的激活表達。在小鼠心臟損傷后，研究人員檢測到在纖維化明顯的區(qū)域出現(xiàn)大量tdTomato陽性的細胞，這些成纖維細胞同時表達αSMA。在損傷后期，成纖維細胞不再表達αSMA，但仍然標記為tdTomato陽性，表明成纖維細胞中短暫表達的間充質(zhì)基因αSMA被EndoMTracer永久地記錄下來。

　　研究人員接著采用了另一個間充質(zhì)的特征基因Zeb1，捕捉心臟內(nèi)皮中Zeb1的激活表達。胚胎期心內(nèi)膜EndoMT中表達過Zeb1的內(nèi)皮細胞被EndoMTracer永久地標記為tdTomato陽性。但是，成體心臟損傷纖維化后，研究人員沒有檢測到明顯的tdTomato信號，說明心臟纖維化過程中，內(nèi)皮細胞不會瞬時激活Zeb1的表達。而部分成纖維細胞能短暫表達Zeb1，在心臟纖維化過程中被EndoMTracer永久記錄下來。

　　綜上，該工作建立了無縫隙捕捉特定基因轉(zhuǎn)錄激活的技術(shù)，揭示了在早期胚胎心臟發(fā)育中內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變的過程，但成體心臟纖維化中內(nèi)皮細胞不會發(fā)生瞬時EndoMT，也不會形成肌成纖維細胞。心臟中的成纖維細胞在損傷過程中會被激活，表達間充質(zhì)基因，并促進損傷區(qū)纖維化，提示心臟纖維化的治療靶點應(yīng)集中在成纖維細胞。

　　分子細胞卓越中心博士研究生張少華為該論文的第一作者，分子細胞卓越中心周斌研究員、上海交通大學(xué)新華醫(yī)院孫錕教授以及香港中文大學(xué)呂愛蘭教授為該論文共同通訊作者。該工作得到了英國阿斯利康Qing-dong Wang教授，上海交通大學(xué)陳豐原教授的大力支持。感謝分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術(shù)平臺對本研究的大力支持，感謝中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經(jīng)費支持。

　　文章鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.121.055417

　　圖：研究人員利用EndoMTracer技術(shù)揭示了胚胎期心內(nèi)膜向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變的過程存在EndoMT，但成體心臟損傷后內(nèi)皮細胞不會發(fā)生EndoMT, 成纖維細胞的激活和轉(zhuǎn)變形成了損傷區(qū)的大量肌成纖維細胞，會瞬時表達間充質(zhì)細胞的基因，促進心臟纖維化及病理重塑。