5月17日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature Communications在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組最新研究進(jìn)展“Genetic fate-mapping reveals surface accumulation but not deep organ invasion of pleural and peritoneal cavity macrophages following injury”。該研究開(kāi)發(fā)了基于Dre-rox與Cre-loxP雙同源重組酶系統(tǒng)的遺傳譜系新技術(shù)，構(gòu)建了可以高效特異標(biāo)記體腔巨噬細(xì)胞的工具小鼠（CD45-Dre;Gata6-iCreER;R26-tdTomato）。同時(shí)揭示了在肝臟和肺臟受到損傷的情況下，體腔巨噬細(xì)胞聚集在損傷表面而不能滲透進(jìn)實(shí)質(zhì)細(xì)胞中參與損傷修復(fù)。該研究為深入清晰認(rèn)識(shí)體腔巨噬細(xì)胞的功能提供了強(qiáng)有力的遺傳學(xué)工具。
巨噬細(xì)胞廣泛分布于各個(gè)組織和器官中，在免疫應(yīng)答、組織修復(fù)和再生等方面具有重要意義。在脊椎動(dòng)物發(fā)育中，存在著各種體腔，包括包圍著肝、腸、胃、脾等內(nèi)臟器官的腹腔，肺臟所在的胸腔以及心臟所在的心包腔。近幾年研究發(fā)現(xiàn)在這些體腔中存在著一類特殊的巨噬細(xì)胞，它們?cè)谇宄w內(nèi)有害物質(zhì)和微生物以及清除死亡組織中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。心臟是人體最為重要的器官，由于其再生和損傷修復(fù)的能力極低，一旦發(fā)生損傷，心臟功能便會(huì)受到不可逆的影響。因此心臟損傷后修復(fù)過(guò)程一直吸引廣大的科研工作者進(jìn)行研究。此前加拿大卡爾加里大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，位于心包腔中的一群GATA6+心包腔巨噬細(xì)胞具有心臟修復(fù)的功能，它們可以遷移進(jìn)實(shí)質(zhì)細(xì)胞參與小鼠心臟損傷后的修復(fù)。早在2016年，他們就發(fā)現(xiàn)在肝臟受到損傷的情況下，腹腔中的巨噬細(xì)胞會(huì)快速附著到損傷區(qū)域參與肝臟損傷修復(fù)。探索巨噬細(xì)胞功能的多樣性及其在病理生理過(guò)程中的功能將為人們提供許多人類疾病治療的新靶點(diǎn)和新思路，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
以往的研究主要是利用Ccr2-tdTomato, Cx3cr1-GFP, LysM-eGFP和Gata6H2B-Venus等單基因熒光報(bào)告小鼠結(jié)合體外移植實(shí)驗(yàn)標(biāo)記示蹤Gata6+巨噬細(xì)胞，缺乏對(duì)體腔巨噬細(xì)胞的直接精準(zhǔn)標(biāo)記和遺傳譜系示蹤。由于單基因示蹤系統(tǒng)的局限性和不特異性，之前的研究結(jié)果缺少令人信服的遺傳學(xué)證據(jù)，關(guān)于體腔巨噬細(xì)胞的功能存在較大爭(zhēng)議。因此，建立一種特異性遺傳示蹤工具小鼠體內(nèi)標(biāo)記這群細(xì)胞并闡明其功能顯得尤為重要。
雖然體腔巨噬細(xì)胞高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GATA6，可以將它與組織駐留型巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，但是GATA6同時(shí)表達(dá)在多種器官的實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，比如肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞等等，這使得GATA6不能被單獨(dú)用于示蹤體腔巨噬細(xì)胞。為了特異性在小鼠體內(nèi)示蹤體腔巨噬細(xì)胞，周斌研究組建立了一種基于Dre-rox和Cre-loxP雙同源重組酶介導(dǎo)的新型遺傳譜系示蹤系統(tǒng)。研究人員同時(shí)構(gòu)建了造血細(xì)胞特異性標(biāo)記的CD45-Dre小鼠和受Gata6啟動(dòng)的CreER小鼠。在這套系統(tǒng)中CD45+的細(xì)胞表達(dá)Dre重組酶，與rox位點(diǎn)發(fā)生同源重組，去除Gata6-rox-stop-rox-CreER（Gata6-iCreER）中間的stop位點(diǎn)，在CD45+的細(xì)胞中將Gata6-iCreER轉(zhuǎn)變成Gata6-CreER小鼠。同時(shí)小鼠經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后，在表達(dá)CD45的基礎(chǔ)上又表達(dá)GATA6的細(xì)胞中，Cre由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，識(shí)別報(bào)告基因R26-tdTomato上的loxP位點(diǎn)發(fā)生Cre-loxP介導(dǎo)的同源重組從而使CD45+Gata6+雙陽(yáng)性的細(xì)胞被標(biāo)記上紅色熒光蛋白（tdTomato）。CD45可以區(qū)分巨噬細(xì)胞（CD45+）和器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞(CD45–)，同時(shí)GATA6 可以區(qū)分體腔巨噬細(xì)胞（Gata6+）和組織駐留型巨噬細(xì)胞(Gata6–)或單核細(xì)胞（Gata6–）。不同于以往依賴單一分子結(jié)合體外移植標(biāo)記追蹤某一群細(xì)胞的研究模式，他們則是通過(guò)雙同源重組系統(tǒng)將巨噬細(xì)胞亞群-體腔巨噬細(xì)胞不可逆的標(biāo)記上紅色熒光蛋白。不僅如此，為了能夠使該系統(tǒng)適用于基因敲除或過(guò)表達(dá)等遺傳學(xué)操作，周斌研究組采用了順序相交的遺傳學(xué)方法，即Dre介導(dǎo)的CreER激活可以靶向任何loxP位點(diǎn)，用于基因功能的研究。研究人員首先建立了嚴(yán)格的驗(yàn)證系統(tǒng)，設(shè)置多種對(duì)照驗(yàn)證該系統(tǒng)標(biāo)記的效率和特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CD45-Dre;Gata6-iCreER;R26-tdTomato小鼠能夠高效特異地標(biāo)記胸腔和腹腔中的巨噬細(xì)胞，既不會(huì)異位標(biāo)記血液中的免疫細(xì)胞，在沒(méi)有他莫昔芬的誘導(dǎo)下也不會(huì)標(biāo)記任何細(xì)胞。該系統(tǒng)的建立為特異性標(biāo)記巨噬細(xì)胞亞群研究其在在器官損傷修復(fù)再生中的的命運(yùn)轉(zhuǎn)變及功能奠定了堅(jiān)實(shí)可靠的基礎(chǔ)。
接下來(lái)為了研究Gata6+巨噬細(xì)胞對(duì)器官損傷修復(fù)的作用，研究人員首先對(duì)CD45-Dre;Gata6-iCreER;R26-tdTomato小鼠給予他莫昔芬誘導(dǎo)標(biāo)記Gata6+巨噬細(xì)胞。靜置一周后構(gòu)建多種肝臟損傷模型，包括外部機(jī)械性導(dǎo)致的熱損傷（heat injury, HI）和低溫?fù)p傷（cryoinjury, CI），內(nèi)部藥物誘導(dǎo)的急性四氯化碳損傷（acute CCl4 injury）、慢性四氯化碳損傷（chronic CCl4 injury）和對(duì)乙酰氨基酚損傷（acetamonophen, APAP）。免疫熒光染色和流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在藥物誘導(dǎo)的肝內(nèi)部損傷模型中幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)tdTomato陽(yáng)性的細(xì)胞。在機(jī)械性導(dǎo)致的肝外部損傷模型中，tdTomato陽(yáng)性的細(xì)胞主要聚集在損傷區(qū)域的表面，并伴有增厚的間皮層。體內(nèi)遺傳學(xué)證據(jù)表明在這些非遺傳操作的損傷模型中tdTomato陽(yáng)性的腹腔巨噬細(xì)胞主要聚集在損傷肝臟表面，很少通過(guò)損傷位點(diǎn)深入肝臟內(nèi)部。此外，利用Ms4a3-CreER工具小鼠示蹤循環(huán)中的單核細(xì)胞以及免疫染色肝枯否細(xì)胞（Kupffer cell）標(biāo)志基因CLEC4F表明在肝臟CCl4損傷模型中，肝組織中GATA6+tdToamto–的細(xì)胞主要是駐留型肝枯否細(xì)胞，而不是循環(huán)中單核細(xì)胞貢獻(xiàn)的巨噬細(xì)胞。
為了進(jìn)一步探討GATA6+巨噬細(xì)胞是否參與其他臟器損傷后的修復(fù)再生，研究人員對(duì)肺臟構(gòu)建了不同的損傷模型。在示蹤胸腔巨噬細(xì)胞的同時(shí)，觀察其是否可以遷移進(jìn)肺實(shí)質(zhì)組織參與損傷后的修復(fù)和再生。同樣地，在給予CD45-Dre;Gata6-iCreER;R26-tdTomato小鼠他莫昔芬誘導(dǎo)標(biāo)記Gata6+巨噬細(xì)胞靜置一周后，構(gòu)建多種肺臟損傷模型，包括博萊霉素?fù)p傷（Bleomycin）、脂多糖損傷（lipopolysaccharide, LPS）和低溫?fù)p傷（cryoinjury, CI）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在藥物誘導(dǎo)的肺泡Bleomycin和LPS損傷中在肺內(nèi)部很少檢測(cè)到tdTomato陽(yáng)性細(xì)胞。在低溫造成的損傷區(qū)域中可以發(fā)現(xiàn)聚集了大量tdTomato陽(yáng)性細(xì)胞，但這些細(xì)胞并沒(méi)有深入進(jìn)入肺內(nèi)部。研究人員利用這個(gè)高效特異示蹤體腔巨噬細(xì)胞的系統(tǒng)再次證明，胸腔巨噬細(xì)胞主要聚集肺臟表面，而不深入肺臟內(nèi)部參與器官修復(fù)。
綜上，該研究的亮點(diǎn)在于開(kāi)發(fā)了一種雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤新技術(shù)來(lái)特異性標(biāo)記巨噬細(xì)胞亞群-體腔巨噬細(xì)胞。該系統(tǒng)突破了傳統(tǒng)的思維模式和技術(shù)局限性，可以不依賴于體外移植實(shí)驗(yàn)，在小鼠體內(nèi)直接標(biāo)記體腔巨噬細(xì)胞研究其細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與功能。不同于以往的技術(shù)手段和方法，全新構(gòu)建的遺傳譜系示蹤技術(shù)可以深入精準(zhǔn)的標(biāo)記體腔巨噬細(xì)胞，在小鼠體內(nèi)得到更為精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這不僅為炎癥細(xì)胞募集提供了新的研究模型，為巨噬細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)全新的領(lǐng)域，也為治療器官炎癥和促進(jìn)組織修復(fù)提供了潛在的治療策略，具有重要的戰(zhàn)略意義。
分子細(xì)胞卓越中心周斌研究組博士后金恒薇、博士后劉擴(kuò)和副研究員唐娟為該論文共同第一作者，周斌研究員為該論文通訊作者。該研究得到了德國(guó)勃林格殷格翰公司、新加坡免疫所Florent Ginhoux教授、南京醫(yī)科大學(xué)季勇教授、上海市胸科醫(yī)院何奔教授、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院王利新教授及國(guó)家蛋白質(zhì)中心（上海）、分子細(xì)胞卓越中心動(dòng)物平臺(tái)和細(xì)胞平臺(tái)的大力支持，并得到來(lái)自中科院、基金委、科技部、上海市科委等部門的經(jīng)費(fèi)支持。
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