北京時(shí)間2月26日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Science以Research Article形式在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組的研究成果“Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair”。該研究首次開(kāi)發(fā)了能夠長(zhǎng)時(shí)程示蹤體內(nèi)細(xì)胞增殖的新技術(shù)，利用該技術(shù)研究人員發(fā)現(xiàn)了成體肝細(xì)胞的來(lái)源，為肝臟再生及疾病臨床治療研究提供了新思路。
細(xì)胞增殖是多細(xì)胞生物體在發(fā)育、生理穩(wěn)態(tài)和組織再生中的基本生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞增殖過(guò)多或者受阻是許多疾病的致病基礎(chǔ)。檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力對(duì)于發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等眾多學(xué)科的研究至關(guān)重要。目前檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法主要有兩種：（1）基于細(xì)胞增殖標(biāo)記物（如Ki67、pH-H3等）的組織化學(xué)染色；（2）核苷酸類(lèi)似物（如BrdU、EdU等）的摻入。不過(guò)，上述檢測(cè)方法都存在著一定的局限性：在時(shí)間上，檢測(cè)的是某個(gè)時(shí)間點(diǎn)而非某個(gè)時(shí)間段內(nèi)的細(xì)胞增殖，就像照相機(jī)，只能拍攝某一瞬間的細(xì)胞增殖信號(hào)，這對(duì)于一些增殖能力較低的細(xì)胞如心肌細(xì)胞、神經(jīng)元等很難檢測(cè)到；在空間上，所有類(lèi)型的增殖細(xì)胞都會(huì)被無(wú)差別的檢測(cè)，容易造成非目的細(xì)胞增殖信號(hào)的干擾，信噪比低、分辨率差。因此，開(kāi)發(fā)一種有效檢測(cè)體內(nèi)細(xì)胞增殖的新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間不間斷、組織特異性地標(biāo)記細(xì)胞增殖尤為重要。
周斌研究組長(zhǎng)期致力于新型遺傳譜系示蹤技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，在該項(xiàng)研究中，他們建立了一種檢測(cè)細(xì)胞增殖的新技術(shù)—ProTracer（Proliferation Tracer）。作為一種遺傳學(xué)技術(shù)，ProTracer突破了傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞增殖方法的思維模式，利用廣泛使用的細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67, 在基于課題組前期開(kāi)發(fā)的Dre-rox和Cre-loxP的雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤技術(shù)（He et al., Nature Medicine 2017）基礎(chǔ)上，利用Dre-rox啟動(dòng)Cre同源重酶介導(dǎo)的細(xì)胞增殖示蹤系統(tǒng)進(jìn)行遺傳標(biāo)記。ProTracer猶如一臺(tái)錄像機(jī)，一旦啟動(dòng)，可以實(shí)現(xiàn)在數(shù)月甚至數(shù)年內(nèi)不間斷地記錄細(xì)胞增殖，這對(duì)于檢測(cè)增殖能力較低的細(xì)胞以及評(píng)估細(xì)胞增殖能力的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程極其有益。并且，ProTracer可以實(shí)現(xiàn)直接檢測(cè)某一特定譜系細(xì)胞增殖情況，避免其他類(lèi)型細(xì)胞增殖信號(hào)的干擾，提高了信噪比和分辨率，使檢測(cè)信號(hào)更直觀，能夠?qū)崿F(xiàn)從器官整體水平上觀察細(xì)胞增殖。此外，ProTracer能夠?qū)崿F(xiàn)活體檢測(cè)細(xì)胞增殖，可以在不犧牲動(dòng)物的情況下，直接在同一個(gè)動(dòng)物上多時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)體內(nèi)細(xì)胞增殖，觀察細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。ProTracer可以廣泛地應(yīng)用于不同組織器官細(xì)胞增殖的檢測(cè)，為發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐。
周斌研究組利用ProTracer研究了在成體肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過(guò)程中肝細(xì)胞的來(lái)源。目前，在肝臟領(lǐng)域，這是一個(gè)亟待解決且具有爭(zhēng)議的重要科學(xué)問(wèn)題。盡管在某些極其嚴(yán)重的肝損傷情況下，膽管細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化貢獻(xiàn)形成肝細(xì)胞，但是在肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過(guò)程中的肝細(xì)胞的更新主要依賴原有肝細(xì)胞的自我增殖。肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位是肝小葉，肝小葉中的肝細(xì)胞由于代謝功能和基因表達(dá)等的不同具有較大的異質(zhì)性，從肝門(mén)靜脈區(qū)到肝中央靜脈區(qū)大體可分為三區(qū)：門(mén)靜脈周?chē)渭?xì)胞（E-CAD+，Zone 1）、中間區(qū)肝細(xì)胞（E-CAD–GS–，Zone 2）和中央靜脈周?chē)渭?xì)胞（GS+，Zone 3）。 有研究認(rèn)為不同區(qū)域的肝細(xì)胞增殖能力顯著不同, 但究竟哪些肝細(xì)胞亞群對(duì)新生肝細(xì)胞起主要貢獻(xiàn)仍存在較大爭(zhēng)議，目前主要有以下幾種理論：（1）肝細(xì)胞流動(dòng)理論（肝細(xì)胞由門(mén)靜脈側(cè)向中央靜脈側(cè)流動(dòng)，Liver 1985）；（2）中央靜脈周?chē)渭?xì)胞理論（Axin2+肝細(xì)胞，Nature 2015）；（3）門(mén)靜脈周?chē)渭?xì)胞理論（Sox9+肝細(xì)胞，Cell 2015）；（4）分散式理論（Terthigh肝細(xì)胞，Nature 2018）；（5）廣泛分布式理論（肝細(xì)胞無(wú)差別增殖，Cell Stem Cell 2020）。以往的這些研究均是依賴單個(gè)分子標(biāo)記分析肝臟中某一肝細(xì)胞亞群的擴(kuò)增能力，缺少對(duì)肝臟整體水平上對(duì)所有肝細(xì)胞增殖能力的分析，猶如盲人摸象，觀察的是事物的局部而非整體，因此很難做出一個(gè)全面準(zhǔn)確的判斷。
周斌研究組突破以往的研究模式，即不再依賴單一分子標(biāo)記追蹤某一肝細(xì)胞亞群的擴(kuò)增情況，而是利用ProTracer技術(shù)去直接標(biāo)記新生的肝細(xì)胞，不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所有肝細(xì)胞類(lèi)群進(jìn)行分析，還可以直觀精準(zhǔn)地展現(xiàn)出新生肝細(xì)胞的來(lái)源。研究人員首先采用廣譜性的ProTracer（所有類(lèi)型細(xì)胞的增殖都能夠被檢測(cè)）在成體啟動(dòng)細(xì)胞增殖的記錄，并在啟動(dòng)后的多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肝細(xì)胞的增殖信號(hào)，結(jié)合E-CAD和GS等肝細(xì)胞分區(qū)標(biāo)記基因免疫熒光共染色，發(fā)現(xiàn)在生理穩(wěn)態(tài)過(guò)程中肝細(xì)胞通過(guò)緩慢的增殖維持自我更新。意外的是，新生的肝細(xì)胞并非來(lái)源于以往報(bào)道的任何一個(gè)類(lèi)群，而是主要來(lái)源于肝小葉中的中間區(qū)域（E-CAD–GS–，Zone 2）。
為了排除非肝細(xì)胞增殖信號(hào)的干擾，研究人員在廣譜性ProTracer技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合肝細(xì)胞特異性表達(dá)的基因Albumin（Alb）啟動(dòng)子，開(kāi)發(fā)了肝細(xì)胞特異性的ProTracer技術(shù)。肝細(xì)胞特異性的ProTracer僅標(biāo)記肝細(xì)胞的增殖，能夠?qū)崿F(xiàn)直接在肝臟器官整體水平上展現(xiàn)肝細(xì)胞增殖。
將肝細(xì)胞特異性ProTracer在成體啟動(dòng)后，研究人員將肝臟的全標(biāo)本進(jìn)行了熒光拍照，發(fā)現(xiàn)被tdTomato紅色熒光標(biāo)記的增殖的肝細(xì)胞呈現(xiàn)出一圈圈類(lèi)似“甜甜圈”的形狀（圖A），說(shuō)明肝細(xì)胞增殖具有區(qū)域偏好性，肝臟組織切片的免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了增殖的肝細(xì)胞位于肝小葉的中間區(qū)域，即E-CAD–GS–的Zone 2（圖B）。此外，周斌組還開(kāi)發(fā)了活體檢測(cè)肝細(xì)胞增殖的ProTracer技術(shù)，利用該技術(shù)他們檢測(cè)了同一個(gè)小鼠個(gè)體在多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞的增殖及其動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，這也是世界上首次實(shí)現(xiàn)活體檢測(cè)細(xì)胞增殖。
為了研究肝臟損傷再生過(guò)程中新生肝細(xì)胞的來(lái)源，研究人員利用ProTracer技術(shù)結(jié)合肝切、膽管結(jié)扎和CCl4等多種肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)在肝切模型中，位于Zone 1的肝細(xì)胞起始肝臟再生過(guò)程，然后Zone 2 的肝細(xì)胞迅速增殖。而在膽管結(jié)扎和CCl4急性損傷模型中，則是位于Zone 2的肝細(xì)胞起始肝臟再生過(guò)程。此外，研究人員利用廣譜性ProTracer系統(tǒng)地描繪了肝臟再生過(guò)程中其他類(lèi)型細(xì)胞的增殖情況，如膽管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。
綜上，該研究的亮點(diǎn)在于開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)細(xì)胞增殖的遺傳新技術(shù)——ProTracer，以全新的視角研究了成體肝細(xì)胞的來(lái)源，突破了傳統(tǒng)思維模式和技術(shù)局限性，直觀地展現(xiàn)了所有肝細(xì)胞類(lèi)群的增殖情況，首次發(fā)現(xiàn)肝小葉中間區(qū)域（Zone 2）的肝細(xì)胞是成體肝臟在生理穩(wěn)態(tài)中新生肝細(xì)胞的主要細(xì)胞來(lái)源，同時(shí)揭示了不同損傷再生模型中新生肝細(xì)胞的來(lái)源，準(zhǔn)確回答了成體肝細(xì)胞來(lái)源這一重要科學(xué)問(wèn)題。該研究為肝臟損傷修復(fù)再生研究開(kāi)辟了新思路，為肝臟疾病的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。
此外，新開(kāi)發(fā)的ProTracer技術(shù)具有長(zhǎng)時(shí)間不間斷檢測(cè)細(xì)胞增殖的能力，可以特異性地標(biāo)記某種特定細(xì)胞譜系的細(xì)胞增殖，并且實(shí)現(xiàn)了不犧牲樣品直接活體檢測(cè)細(xì)胞增殖，從多個(gè)維度刷新了細(xì)胞增殖檢測(cè)的能力和范圍，可以廣泛應(yīng)用于不同組織器官細(xì)胞增殖的檢測(cè)，為發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究提供強(qiáng)大技術(shù)支撐。
中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組副研究員何靈娟博士（現(xiàn)就職于西湖大學(xué)）、博士后蒲文娟、博士研究生劉秀秀為該論文的共同第一作者，周斌研究員為該論文通訊作者。該工作得到了瑞士諾華醫(yī)學(xué)生物研究所的Jan S. Tchorz教授、南京醫(yī)科大學(xué)季勇教授、瑞典阿斯利康 Qing-Dong Wang博士和上海南方模式生物公司的孫瑞林博士及其團(tuán)隊(duì)的大力支持。該工作也得到分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心動(dòng)物平臺(tái)和細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)的大力支持，并得到來(lái)自中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門(mén)的經(jīng)費(fèi)支持。
圖：（A）利用肝細(xì)胞特異性的ProTracer標(biāo)記增殖肝細(xì)胞的成體小鼠肝臟。tdTomato+的增殖肝細(xì)胞呈現(xiàn)出一圈圈的類(lèi)似“甜甜圈”的形狀。（B）利用ProTracer揭示成體肝臟中新生肝細(xì)胞（tdTomato+）主要來(lái)源于E-CAD–GS– Zone 2。E-CAD（綠色）；GS（青色）。
