劉望夷（1934-2022），1960年北京大學生物系生物化學專業(yè)畢業(yè)，1965年中國科學院上海生物化學研究所研究生畢業(yè)，中國科學院上海生物化學研究所研究員，1959—1960 年在鄒承魯先生指導下在胰島素二硫鍵拆合組學習做實驗。
劉望夷
今年是我國成功化學合成結晶牛胰島素發(fā)表50周年。我大學畢業(yè)前后曾參加過早期牛胰島素A、B鏈的二硫鍵拆合工作，在工作中學習到很多知識。為紀念半個世紀前我國科學家所作的貢獻，本文記述我參加這項工作的經(jīng)歷、見聞和印象。
1 第一次來生化所
1959年2月寒假結束后，我讀四年級下學期。因為北大生物系和化學系與生化所準備合作做人工合成胰島素的工作，開學后區(qū)樂昌(助教) 先生帶領我班幾個同學(王志美、汪開圣和我等) 從北京來上海到生物化學研究所參觀學習。到上海后我們住在桃江路7號科學院宿舍。在實驗室參觀學習三天，收獲確實不小。我們就像劉姥姥闖進大觀園，大開眼界。很多實驗用品，以前都是聞所未聞，見所未見。像大大小小的層析柱、紙層析缸、紙電泳儀等這些現(xiàn)在看來很簡單的儀器，當時在北大生化實驗室里都沒有見過。其實，柱層析、紙層析這些當時的先進技術，早在20世紀40年代中后期就用于氨基酸和小肽的分離和鑒定。由于對發(fā)展和應用這些實驗技術的卓越貢獻，A.J.P. Martin 和R.L.MSynge 獲得1952年諾貝尓化學獎。20世紀50年代連這些簡單的實驗設備都很少見，說明當時我國高校實驗室的儀器設備實在太落后了。
我們回校不久，生化所曹天欽先生率鄒承魯先生和鈕經(jīng)義先生等到北京，同北大化學系和生物系與人工合成胰島素有關的師生見面，討論協(xié)作問題。他們在生物樓101教室作了學術報告。出席這次會議的有生物化學教研室的三位教授：陳同度先生、沈同先生和張龍翔先生，聽學術報告的還有生化專業(yè)55、56級高年級學生。參加這次學術報告會的有沒有化學系的師生，現(xiàn)在記不清了。
此后不久，生物系區(qū)樂昌先生和生化專業(yè)高年級學生與化學系邢其毅先生和有機化學專業(yè)高年級學生在地學樓底層一個教室里聯(lián)合舉行人工合成胰島素學術討論會。在當時“大躍進”的發(fā)熱氣氛中，學生學到的書本知識雖然不多，但本著“敢想、敢說、敢干”的精神，大家都踴躍發(fā)言，各抒已見，爭論激烈，很難達成一致意見。關于人工合成胰島素旳方案(路線)，記得當時會上討論的主要有兩個：(1)兩條鏈方案。分別合成兩條A、B鏈，然后氧化合成有活性的胰島素。這條路線比較容易。(2) “工”字型方案。胰島素分子內(nèi)有兩個”工”字型含二硫鍵的多肽鏈，分別合成這兩個“工”字型多肽鏈，再合成有活性的胰島素。這條路線比較復雜。這些方案究竟是以前就討論過、議論過，還是聽曹、鄒、鈕三位先生報告后產(chǎn)生的，現(xiàn)在就不得而知了。無論怎樣，后來化學系與生物系提出的路線與生化所的方案是沒有矛盾的，沒有爭議的。因為當時兩系有關領導人對這項工作有工作經(jīng)驗的不多，最后，各方領導取得共識：分別合成胰島素A、B兩條鏈，再合成有活力的胰島素。于是，北大生物系領導決定派區(qū)樂昌先生帶領我和同班同學程明哲兩人再到上海生化所學習胰島素A、B 鏈拆合和測定胰島素活性的方法。
2 再來生化所學習
1959年3月，區(qū)樂昌先生又帶領我和程明哲第二次來到生化所。當時生化所實驗室在岳陽路320號大院一幢三層大樓內(nèi)。這幢大樓是原中央研究院醫(yī)學籌備處使用的實驗室。我們到三樓一個辦公室與鄒承魯先生見面。當時鄒先生給我的印象是非常年輕。鄒先生當時負責領導胰島素A、B 鏈二硫鍵拆合組(簡稱拆合組或二硫鍵拆合組)。拆合組實驗工作主要在三樓一間向南的大實驗室。其組員有：杜雨蒼、徐琴鈺、許根俊、殳邦英、魯子賢和張友尚。他們各有自已與拆合有關的課題。鄒先生安排我和程明哲主要與杜雨蒼和徐琴鈺在一起學習。
人工合成胰島素，早期就提出多種途徑實現(xiàn)這個目標。A、B鏈的拆合，大多數(shù)人認為是一個比較可行的方案。已經(jīng)知道，胰島素A、B鏈的拆開和分離比較容昜。F. Sanger在測定胰島素的氨基酸序列時，已經(jīng)用過甲酸氧化后經(jīng)紙電泳分離，得到–SO3 (二硫鍵中的胱氨酸氧化為磺酰丙氨酸，即cysteic acid ) 型A、B鏈。用這種A、B鏈不能直接合成胰島素，必須還原成-SH型A、B鏈才行。當時尚不能做到直接從-SO3 型轉(zhuǎn)變成-SH型。直接用巰基乙酸還原胰島素可得到-SH型A、B鏈，但這種類型的–SH基容易氧化，很不穩(wěn)定。這樣看來，用A、B鏈合成胰島素這個方案還存在很多尚待解決的困難。生化所所長王應睞先生很重視這些問題，安排鄒先生領導拆合組，組內(nèi)成員大多數(shù)有做研究工作的經(jīng)驗，能力強。杜雨蒼是1958 年北大生物系畢業(yè)分配到生化所工作的。他是比我高一級的同學，因為杜和我在學校都當過班長，所以在學校我們就認識。當時在“大躍進”的氣氛下，人們的工作熱情很高。我們和杜雨蒼一起工作，深感他工作積極，學習刻苦，肯動腦子，解決問題的能力強。他一天從早到晚和周末都到實驗室工作。但他畢竟到生化所工作時間還不到一年，沒有多少實驗經(jīng)驗，在遇到不能解決的問題，感到一籌莫展的時侯，就拿著實驗記錄本到鄒先生辦公室向鄒先生匯報。我和徐琴鈺、程明哲總是跟著去。鄒先生聽了匯報后耐心地詳細回答他提出的各種問題，并分析產(chǎn)生這些問題的原因，提出解決方法，指導得非常具體。他有條有理的講解，既有基礎知識又啟發(fā)我們學習應該怎樣從事科學研究，學會從各方面思考問題，要敢于實踐( 做實驗)，敢于提出自己的不同想法。我們從他的辦公室滿意地出來后，就好像剛上完一堂受益匪淺的課，感到學習了很多知識。對那些困擾我們的問題茅塞頓開，知道下一步該怎么做了。
鄒先生也常到大實驗室看我們做實驗，我們有了問題可以隨時問他。有一次，他在實驗室看到我正在用一支較大的玻璃吸量管吸取5N NaOH 溶液。他當場嚴肅地批評我說：“你這樣用嘴吸取濃的NaOH，吸到嘴里要燒傷你的口腔，應該用橡皮球吸??！”我當時感到非常尷尬。鄒先生是出于愛護學生批評我的。這件事使我終生不忘。我們在學校時很少做實驗，尤其在“大躍進”時期，實驗室亂七八糟，鬧哄哄的，我們根本沒有受過嚴格訓練。從此以后做實驗碰到可能有危險的時侯，我就非常注意了。做了幾十年實驗沒有受過傷害，再沒有做過像用嘴吸量燒堿那樣的蠢事了。后來我指導研究生時也曾多次不客氣地批評過他們的錯誤，我想他們同樣也會理解我的。
20世紀50~70年代，科學院實驗室的儀器設備雖比高校好些，實際上還是很落后的。從國外進口儀器更加困難。當時社會上大力提倡自力更生，研究所更要自己動手制作一些實驗必需的儀器設備。生化所有附屬工廠，廠內(nèi)有技術水平很高的熟練工人，如玻璃工、金工、木工、電工和儀器設備維修工等。實驗室需要一些特殊儀器設備，市場上買不到的，研究人員可以自行設計，畫出圖紙交給工廠去做。如有特殊需要，難以畫出圖紙時，我們與工廠技術人員一起討論，提出明確要求，他們也能做出合用的儀器或設備。比如當時市場上買不到的實驗室用恒溫水浴，科研人員與工人合作，就用一個盛有30~40升水的大玻璃缸，上面裝一個電熱棒(放在水中) 和一個小型電動攪拌馬達，兩者都與一個繼電器聯(lián)在一起，再裝上一個盛有水銀的小型玻璃管，里面安裝一個也與繼電器相聯(lián)可上下調(diào)控的金屬細針。這樣啟動了繼電器，電熱棒將水加熱，馬達將水攪動起來，直至水熱到玻璃管內(nèi)水銀柱與金屬針接觸，才停止加熱，停止攪動水。調(diào)節(jié)金屬針的高度，就可達到所需水溫。這種土法裝配的恒溫水浴，實驗室一直使用到20世紀60年代末。另外，杜雨蒼還特別設計了一種專門用于拆合實驗的體積很小的三通玻璃管，一個管口加樣品，另一個將空氣( 氧氣) 直接通入反應液內(nèi)，第三個在液面通空氣。這也是研究所玻璃工的作品。使用這種三通試管做實驗效果很好。杜雨蒼和我們還經(jīng)常到樓下冰庫用髙壓電泳儀分離A、B鏈。這個實驗很危險，必須先切斷電源才能操作。后來，這種高圧電泳儀就不再使用了。
除了參加實驗外，空閑時我還常到分院圖書館查閱與胰島素有關的文獻。那時圖書館在320 號實驗大樓內(nèi)，不出大樓就可以到圖書館看書，很方便。館內(nèi)設有閱覽室、參考室，室內(nèi)專門集中放置生化等生物學方面的雜志和工具書等，還有ChemicalAbstract，查閱很方便。當時研究胰島素的文章很多，主要有關它的結構與功能的關系、經(jīng)過化學修飾后對其活力的影響，以及改善臨床應用等方面的文章。查文獻主要是為了學習知識和提高英文閱讀能力。即使在閱讀中產(chǎn)生了一些想法在生化所不能做，回到學校也做不了。因為在當時的政治氣氛中，只能做那些工作量較大，能集體工作的，即“大兵團作戰(zhàn)”的項目。不提倡個人有什么想法，獨立思考做課題?，F(xiàn)在的319 號分院圖書館當時正在啟建。1960年分院圖書館才搬入319 號新址。
在三樓大實驗室做實驗的人比較多。與杜雨蒼一起做實驗的就有五位。許根俊做鈉氨實驗常用大實驗室通風櫥。魯子賢研究A、B鏈的物化性質(zhì)。孫玉琨是鄒先生的研究生正在做他的畢業(yè)論文，不參加胰島素合成的工作。張友尚常在樓下冰庫里分離A、B鏈。在大實驗室做實驗的龔岳亭探索用蛋白水解酶的可逆反應，即轉(zhuǎn)肽法，合成多肽。他一個人做實驗，不多講話，按時上下班。經(jīng)過一段時間的探索他向胰島素大組作了工作匯報，認為轉(zhuǎn)肽法此路不通，不再做這個題目，改做別的工作了。
蛋白水解酶在特殊條件下可以合成肽鍵，即轉(zhuǎn)肽反應，這是常識。一般酶催化的反應除了正向反應外，都有逆反應。這樣的例子很多。例如紅色面包核酸酶(RNase N1) 在特定條件下可以合成有限的寡核苷酸。著名旳多核苷酸磷酸化酶(PNPase) 更是一個明顯例子：在磷酸存在下該酶水解RNA為各種核苷二磷酸(NDP)。沒有磷酸條件下，該酶可以將各種NDP合成大分子RNA，從一個NDP中釋放一個磷酸。在酶催化反應過程中，正逆兩個反應速度常數(shù)的大小如果反轉(zhuǎn)，則酶催化的反應向另一方進行，反之亦然。問題是用酶催化法合成蛋白質(zhì)與原來提出項目的宗旨是否相悖？至今還在爭論。
胰島素的二硫鍵拆合工作經(jīng)過幾個月的摸索，不斷改進實驗條件，約在1959年5月，使用經(jīng)氧化還原、離子交換或電泳得到的純A、B鏈重合成胰島素終于獲得成功。首次觀察到將天然A、B鏈重組的胰島素注射到小白鼠皮下產(chǎn)生驚厥反應并死亡的實驗結果。“小白鼠一跳”當時在生化所備受關注，這是我親眼看到的。這個結果是以杜雨蒼為主獲得的，該實驗的成功引起胰島素人工合成大組的高度重視，為此專門召開了一次胰島素大組會議，確定了A、B 鏈的拆合路線是可行的。
胰島素大組經(jīng)常召開會議，各人匯報工作進展，討論實驗中的問題。會議常由曹天欽先生主持，匯報和討論工作后，曹先生有時會提出北大兩位同學有什么想法或者意見。生化所旳老師和同事都看著我們，希望我們發(fā)言。可是我們兩個都沒有發(fā)過言，不是沒有想法或不想發(fā)言，主要是由于受中國傳統(tǒng)文化的影響和社會上不良習慣的束縛?？傆X得年輕人要謙虛謹慎，在老師面前要必恭必敬，不可班門弄斧，唯恐一個在校學習的學生給人留下不好的印象。
我們兩個北大學生這次住在分院太原路200號一幢三層樓集體宿舍里。后來所里發(fā)生過一件大事，據(jù)說三樓實驗室的一位工作人員手里拿著一個“燈泡瓶”在窗口旋轉(zhuǎn)混勻內(nèi)有八肽的溶液，一不小心“燈泡瓶”由三樓墜落、粉身碎骨，大家也非?？上列量嗫嗪铣傻陌穗牟荒芑厥樟恕＿@件大事當時稱為“八肽跳樓”。7月底系里領導通知我們回學校參加期終考核。于是我們就辭別生化所的老師和朋友回學校去了。
3 回學校斷斷續(xù)續(xù)做胰島素活力測定工作
我們回到學校第一件事就是參加期終考核。有的課程考核已經(jīng)結束，有的正在進行。我們兩人在生化所學習差不多一個學期。學期初有的課程上過幾次，有的就根本沒有上過。我們只好自學幾天，參加考核也就通過了。
在北京大學生物系搞科研，儀器設備非常差，要弄齊必需的儀器得花費很多時間，一面上課一面東奔西跑“跑儀器”。胰島素合成工作由生物系與化學系合作進行，1960 年春季五年級最后一個學期，領導上派我到化學系與他們一起做實驗?；瘜W系安排我在化學樓二樓北側一間大實驗室做實驗，我負責測胰島素活力。測活力用的小白鼠要到生物系動物房去取。因為每次使用的數(shù)量不多又不常使用，動物房的人就給了我?guī)资恍“资蠛惋暳?/span>, 要我們自用、自養(yǎng)、自繁殖。這下可麻煩了，小白鼠繁殖力極強，我得喂養(yǎng)、分籠( 當時使用的是土瓦罐)、打掃瓦罐，工作量很大，累得我夠嗆。動物要吃喝，一天不去實驗室也不行。有時一不小心，小白鼠逃出瓦罐在實驗室到處亂跑。化學系的實驗室變成了動物房，滿屋一股大小便臭味，但為了工作也要養(yǎng)小白鼠。不久，化學系派一個低年級女學生(步XX)與我合作，學習在小白鼠皮下注射胰島素測定活力的方法。我們叫她“小步”。她學會后，我就不用來化學樓養(yǎng)小白鼠了。
4 畢業(yè)分配到生化所，開始也做有關胰島素的工作
1960年8月，北大生物系分配我到中國科學院當研究生。我到當時還在文津街的院部報到，院部對我說，因為我是學生化的，已經(jīng)分配我到生物化學研究所了。同年9月我來上海到生化所報到。人事科張錫鐸科長對我說，現(xiàn)在生化所正在準備調(diào)整研究工作，以前你曾在胰島素組學習過，現(xiàn)在暫時安排你在鄒承魯先生胰島素組學習。鄒先生那時是“三大隊”的隊長。當時所里正處在“大躍進”的尾聲。中央已提出“調(diào)整、鞏固、充實、提高”的方針，所里正在忙于召開各類人員的座談會。當時叫“神仙會”，征求大家對“大躍進”的意見。
我到組里與魯子賢合作用pH 儀測定胰島素A鏈的酸性程度，因為當時已經(jīng)知道A鏈在pH 1.9 的緩沖液中向正極泳動，說明它相當酸。后來聽說關于胰島素A鏈的性質(zhì)的這項工作單獨發(fā)表了一篇短文。這項工作結朿以后，鄒先生安排我做木瓜蛋白酶的純化工作。當時孫玉琨有木瓜蛋白酶的粗制品。那時已是寒冬，實驗室沒有任何取暖設備，很冷。我用平板紙電泳儀在實驗室溫度較低的條件下將這種粗制品分成了幾條蛋白帶( 茚三酮染色)。我向鄒先生匯報后，鄒先生看了很高興，說可以測量每條帶的蛋白質(zhì)含量占多少，是否每條帶都有酶活性，各占多少？這些問題現(xiàn)在看來很容易解決。我在當時就不知道怎樣做。1961年春節(jié)快到了，這個實驗沒有再做下去。春節(jié)過后我就到二樓剛建立的核酸室學習去了。我在鄒先生小組前后學習了近一年的時間。雖然我不是他的入室弟子，在討論工作中從他常說的要學會如何發(fā)現(xiàn)問題、提出問題、解決問題、總結問題，學到了許多寶貴知識，初步知道了怎樣從事科學研究。我以后再沒有遇到能提出好課題并指導學生具體地解決問題的好老師?？梢哉f鄒先生實際上是我從事科研工作的啟蒙導師。
人工合成胰島素的科學意義已有許多文章論述。我認為在人工合成牛胰島素的工作中，二硫鍵拆合工作是最大的亮點。當時通過我國科學家的二硫鍵拆合方法的研究使天然A、B鏈重組活力恢復達到50%，化學合成的結晶胰島素達到與天然胰島素相同的活力。就是現(xiàn)在做二硫鍵拆合的科學家也認為這是很高的水平。這項工作引起國外高度重視，特別是用基因工程法生產(chǎn)胰島素和其他含二硫鍵的多肽激素工作，對由A、B鏈合成胰島素的條件給予很高的評價。
在人工合成胰島素的過程中促進了國內(nèi)生化制品的生產(chǎn)。20世紀50年代我國的科學技術落后，人工合成胰島素必需的各種氨基酸和有關試劑國內(nèi)市場上買不到。由國外進口，缺少外匯，必需自力更生，自己生產(chǎn)。生化所因開展這個重大項目創(chuàng)辦了由沈昭文先生為廠長的“東風生化試劑工廠”，為人工合成胰島素生產(chǎn)出各種氨基酸及各種必需的化學試劑。東風廠為人工合成胰島素立了大功。后來，東風廠還生產(chǎn)很多其他生化制品，如多種酶類等。全國各地高校和科研機構常到東風廠購買這些制品，對推動國內(nèi)生化教學和科研事業(yè)的發(fā)展起了很大作用。
在人工合成胰島素這項工作中，生化所、有機化學所和北大化學系都培養(yǎng)了一批科研人才，后來他們成為我國生物化學界的中堅力量。
（本文原發(fā)表于《生命科學》2015年第27卷第6期）